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Jul 01, 2023

높은

Nature(2023)이 기사 인용 449 Accesses 304 Altmetric Metrics 세부 정보 항생제 결합 부위는 필수 효소의 중요한 도메인에 위치하고 있으며 다음과 같은 분야에서 광범위하게 연구되었습니다.

네이처(2023)이 기사 인용

449 액세스

304 알트메트릭

측정항목 세부정보

항생제 결합 부위는 필수 효소의 중요한 영역에 위치하며 저항성 돌연변이와 관련하여 광범위하게 연구되었습니다. 그러나 그들의 연구는 긍정적인 선택에 의해 제한됩니다. 이러한 제약을 극복하기 위해 다중 게놈 공학1을 사용하여 우리는 대장균 RNA 중합효소(RNAP)의 전체 리팜피신 결합 부위를 포함하는 760개의 단일 잔기 돌연변이 모음을 생성하고 특성화합니다. 약물-효소 상호 작용을 유전적으로 매핑함으로써 우리는 돌연변이가 리팜피신 결합을 상당히 강화하거나 방해하는 알파 나선을 식별합니다. 우리는 이 영역에서 항생제 결합을 연장시켜 치명적인 DNA 절단을 유도함으로써 리팜피신을 정균제에서 살균제로 전환시키는 돌연변이를 발견했습니다. 후자는 복제 의존적이며 리팜피신이 프로모터에서 해로운 전사-복제 충돌을 일으켜 죽임을 나타냅니다. 우리는 또한 RNAP의 속도를 크게 증가시키는 추가적인 결합 부위 돌연변이를 식별합니다. Fast RNAP는 세포의 뉴클레오티드를 고갈시키고, 다른 항생제에 대한 세포 민감도를 변경하며 저온 성장 이점을 제공합니다. 마지막으로, 자연적인 rpoB 서열 다양성을 매핑함으로써 우리는 RNAP 특성을 변경하거나 약물 저항성을 부여하는 기능적 리팜피신 결합 부위 돌연변이가 자연에서 자주 발생한다는 것을 발견했습니다.

임상적 내성2,3,4 퇴치에서의 중요성 외에도 항생제 내성 돌연변이에 대한 연구는 기본적인 생물학적 과정에 대한 이해를 향상시켰습니다5. 항생제는 박테리아 생존에 필요한 효소를 표적으로 삼아 기능하기 때문에 저항성 돌연변이는 RNA 폴리머라제6,7,8,9,10(RNAP) 및 리보솜11,12,13,14과 같은 필수 세포 기계의 특성을 파악하는 데 중요한 역할을 했습니다. 저항성 돌연변이는 항생제 표적의 기능을 실수로 변경하여 필수 효소의 다양한 기능6,11,15, 조절16 및 생리학적 특성12,17,18에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 항생제 결합 부위를 표현형 핫스팟으로 식별하는 것으로 나타났습니다.

박테리아 RNAP의 특정 억제제인 ​​리팜피신(Rif)의 결합 부위는 저항성 돌연변이의 초기 유전적 발견을 확인하는 고해상도 구조에 의해 잘 정의됩니다. Rif의 고친화성 결합은 초기 RNA가 3개의 뉴클레오티드 길이를 초과하는 확장을 방지하고 저항성 돌연변이에서는 Rif 결합이 손실됩니다. 종합적으로, 저항 돌연변이는 전사 주기의 각 단계에서 돌연변이 효소의 특성 변화의 결과인 표현형의 매혹적인 폭을 나타냅니다. Rif는 고주파 저항으로 악명 높지만4,25,26 알려진 저항성 돌연변이 스펙트럼은 RNAP의 β-서브유닛의 이 영역에서 중복되지 않는 돌연변이 공간의 5% 미만을 만듭니다. 따라서 Rif 바인딩 사이트에 대한 기능적 이해는 아직 불완전합니다.

시퀀싱과 함께 다중 자동화 게놈 엔지니어링(MAGE)은 양성 선택 및 낮은 돌연변이율의 제약이 없습니다27,28,29. 이 시스템을 사용하면 매우 높은 효율성과 특이성으로 박테리아 염색체의 관심 영역에 돌연변이를 도입하고 모니터링할 수 있으며 이전에는 필수 유전자 infA 및 rpoD 전반에 걸쳐 코돈 최적화 및 서열 다양성을 특성화하는 데 사용되었습니다.

이 연구에서 우리는 Rif 결합 부위의 각 위치에서 가능한 모든 치환을 포괄하는 RNAP 돌연변이 모음을 생성합니다. 우리는 Rif 결합 상호 작용에 대한 자세한 유전 지도를 제공하고 돌연변이가 Rif 효능을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 rpoB 521-526에 걸친 알파 나선을 식별합니다. 이 영역에서 우리는 결합 친화도를 높이고 DNA 손상을 유발하여 Rif를 정균 약물에서 살균 약물로 전환하는 단일 잔기 돌연변이를 발견합니다. 우리는 살균 효과가 활성 복제에 의존한다는 것을 보여 주며, 이는 Rif에 의해 프로모터에 갇힌 RNAP가 해로운 전사-복제 충돌을 일으킨다는 것을 나타냅니다. 우리는 빠른 RNAP를 생성하는 Rif 결합 부위의 다른 단일 잔기 돌연변이를 설명하고 높은 전사 속도가 뉴클레오티드 세포를 고갈시켜 항생제에 대한 감수성을 증가시키지만 불량한 종결을 통해 저온에서 성장 이점을 제공하므로 유익할 수도 있음을 확인했습니다. 능률. 높은 진화 보존에도 불구하고 우리는 자연에서 높은 빈도로 발생하는 기능적 Rif 결합 부위 돌연변이를 식별합니다. 우리의 연구는 Rif 결합 부위가 RNAP의 다기능 도메인임을 보여 주며, 그 특성화는 Rif의 항균 잠재력과 전사 속도와 박테리아 생리학 사이의 관계에 대한 이해를 넓혀줍니다.