블로그

Jun 26, 2023

픽셀

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 2934(2023) 이 기사 인용 943 3 Altmetric Metrics 세부 정보 액세스 세포 과정에서 신호 종 간의 실제 상호 작용은 종종 다음과 같습니다.

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 2934(2023) 이 기사 인용

943 액세스

3 알트메트릭

측정항목 세부정보

세포 과정에서 신호 종 간의 실제 상호 작용은 종종 발현 수준보다 더 중요합니다. Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 2~10 nm 범위의 근접성에 매우 민감하기 때문에 분자 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용되는 도구입니다. 스펙트럼 유출 보정 정량(3큐브) FRET는 비용 효율적이고 다양한 접근 방식으로 유세포 분석 및 형광 현미경 검사법의 다양한 양식에 적용할 수 있지만 다양한 수준의 자가형광으로 인해 방해를 받을 수 있습니다. 여기에서는 모든 스펙트럼 유출 요인을 정확하게 결정할 수 있는 자동 형광이 없는 무세포 교정 표준을 활용하여 현미경 검사법 FRET 측정에서 픽셀별 자동 형광 보정을 구현했습니다. 또한 단일 이미지의 대화형 분석은 물론 대규모 이미지 세트의 정량적 FRET 효율 맵 자동 생성을 위한 ImageJ/Fiji 플러그인도 제공합니다. 검증을 위해 우리는 다양한 신호 대 자가형광 비율 및 FRET 효율성을 다루는 비드 및 셀 기반 FRET 모델을 사용하고 기존 평균 자가형광/배경 보정과 접근 방식을 비교했습니다. 픽셀별 자가형광 보정은 특히 공간적으로 다양한 자가형광 및 낮은 형광 대 자가형광 비율을 갖는 샘플의 경우 결과 정확도가 우수한 것으로 입증되었으며, 후자는 종종 생리학적 발현 수준의 경우입니다.

Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 형광 공여 염료와 스펙트럼상 적절한 수용 염료 사이의 비충돌 비방사 에너지 전달이며, 실제 목적을 위해 종종 형광으로 선택됩니다1. 1960년대 후반부터 FRET는 점차 거대분자 간의 근접성을 결정하는 데 널리 사용되는 도구가 되었습니다. 에너지 전달 효율(E)은 공여체 염료와 수용체 염료 사이 거리의 6승 역함수로, 2~10nm 범위에서 빠르게 변합니다. 이러한 감도 범위는 회절로 인해 분해능이 낮아져 제한되는 광학 기기에서도 분자 수준의 상호 작용을 설정하고 비교하기 위한 기초 역할을 합니다2. 급속히 발전하는 초해상도 기술이 해상도 한계를 점점 더 낮추고 있음에도 불구하고 FRET 기술을 위한 공간은 많이 남아 있습니다3. 단일 분자 측정에서 앙상블 접근법에 이르기까지 현미경으로 FRET를 측정하는 다양한 접근법이 있으며, 그 중 대부분은 고가의 계측이 필요하지 않거나 샘플7,8,9에 비파괴적입니다. 여기에는 기증자/수용자 화학량론10이 알려진 형광 단백질 기반 바이오센서의 계속 확장되는 분야에서 가장 잘 사용되는 비율 측정 방법뿐만 아니라 기증자/수용자 화학량론과 관계없이 보정된 FRET 효율을 산출하는 정량적 측정 방식이 포함됩니다. 이 중에서 형광 수명 이미징(FLIM)은 본질적으로 정량적 방법을 나타내지만 고급 계측이 필요하며 스펙트럼 스필오버 보정(또는 3큐브) FRET는 유세포 분석 및 기존에 적용할 수 있는 비용 효율적이고 다양한 접근 방식입니다. 형광현미경. 또한 널리 사용되는 수용체 광표백 기술14,15과는 달리 시간 경과 및 3D 이미지 분석과 함께 사용할 수도 있습니다.

FRET 측정을 위한 모든 방법의 주요 제한 사항은 신호 대 잡음비(SNR)입니다. SNR은 신호의 예상 값을 SD로 나눈 값입니다. 여기에서 추가 계산에 사용되는 측정된 모든 형광 강도의 노이즈는 FRET 효율로 전파됩니다. 예상 값 λ를 사용하여 픽셀당 감지된 광자의 포아소니안 분포를 가정하면 체계적인 노이즈가 무시할 수 있는 경우 SNR은 √λ이므로 강도가 낮을수록 결정된 FRET E의 불확실성이 더 크게 증가할 것으로 예상됩니다. 낮은 SNR을 가진 샘플은 형광 염료의 양자 효율과 광안정성을 개선하고, 보다 효율적인 검출을 사용하고, FRET 염료 쌍을 최적화하고, 향상된 수학적 및 통계적 접근법을 통해 FRET 분석에 더 적합하게 만들 수 있습니다. 23. 스펙트럼 유출 보정 방법을 사용하면 일반적으로 ~5% 이상의 FRET 효율이 나타날 때 기존 분자 상호 작용에 대한 결론을 내릴 수 있습니다.